Apuntes de Procesamiento de Muestras

FIJACIÓN

• Este proceso tiene como objetivo principal estabilizar las estructuras celulares, produciéndose modificaciones en las proteínas por efecto del proceso de denaturación de ellas.
• La denaturación proteica implica un proceso o secuencia de procesos en los cuales el  ordenamiento espacial que tiene una proteína nativa es cambiado o alterado. Estos cambios pueden ser de dos tipos: conformacionales o configuracionales.
• La estabilidad conformacional de las proteínas es muy baja lo que hace que fácilmente sean denaturadas, alterándose el balance de las uniones débiles que mantienen la conformación nativa.
• El proceso de denaturación implica especialmente cambios en la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas (sin embargo, a veces puede afectar la estructura secundaria, pero nunca afecta la estructura primaria, ya que no se rompen enlaces covalentes).

Agentes denaturantes:  

• Calor, cambios de pH, uso de detergentes, uso de soluciones deshidratantes, uso de altas concentraciones de sustanciaas orgánicas.

Criterios de fijación :

• Estudio morfológico a microscopía de luz
• Estudio morfológico a microscopía electrónica (MET y/o MEB)
• Estudio histoquímico
• Estudio inmunocitoquímico o inmunohistoquímico

Principales fijadores químicos

a)      Fijadores que poseen grupos aldehídos: formaldehído, glutaraldehído.

b)      Fijadores que contienen metales pesados:

§  Sales y óxidos de cromo

§  Sales de mercurio

c)       Solventes orgánicos: etanol, metanol, acetona.

d)      Fijadores ácidos: ácido acético, ácido pícrico, ácido tricloracético, ácido ósmico (tetróxido de osmio).

INCLUSIÓN

  Medios de inclusión: Son las sustancias soportantes que se agregan a los espacios intracelulares e intercelulares y/o a los intersticios de los tejidos con el fin de endurecerlos y dar  un medio homogéneo que permita la obtención de cortes semifinos y finos de un grosor uniforme.

Clasificación de los medios de inclusión:

1.       HIDRÓFOBOS O ANHIDROS:

• Se utilizan previa deshidratación de las muestras y pasajes por líquidos que sean miscibles con el deshidratante y con el medio de inclusión.
• Ejemplos:parafina,paraplast,resinas epoxi,resinas acrílicas,celoidina,paraplast-celoidina

2.       HIDRÓFILOS O ACUOSOS:

• Se utilizan inmediatamente después del proceso de fijación y del lavado de las muestras en agua
• Ejemplos:carbowax,gelatina,agar

Factores que afectan el proceso de inclusión:

• El grosor de la muestra (ideal 1.5 a 5 mm de grosor para microscopía de luz)
• La naturaleza del tejido Ej: tejidos densos como el cerebro, huesos, piel, requieren tiempos más largos que el riñón.
• El fijador utilizado (si es coagulante o aditivo).
• Los deshidratantes o líquidos intermediarios utilizados
• El uso de vacío, a presión reducida, puede disminuir a la mitad el tiempo de impregnación en el medio de inclusión.
• La temperatura, el calor aumenta el intercambio de líquidos, pero endurece los tejidos y provoca retracción
• La viscosidad de los reactivos utilizados es directamente proporcional a los tiempos utilizados.

MICROTOMÍA

Clasificación de los micrótomos
Micrótomos de cuchillo fijo	Rotatorio o tipo Minot	Para cortes de tejidos incluidos en parafina
	De deslizamiento
Micrótomos de cuchillo móvil	De congelación	Para cortes de tejido fresco y fijado, incluido o sin incluir en gelatina
	De deslizamiento	Para cortes de tejidos incluidos en celoidina
Crióstatos	Son de tipo Minot, adaptados en una cámara fría para hacer cortes a baja temperatura (0ºC a -60ºC)
Ultra micrótomos	Para cortes finos y ultrafinos par M.E.T.

    Micrótomo rotatorio de tipo Minot: La operación de este micrótomo está basada en la acción rotatoria de una rueda manual que activa el avance del bloque de inclusión hacia un cuchillo de acero, sostenido rígidamente en el carro portacuchillo.

 

• Crióstato: Este es un micrótomo tipo Minot que va colocado dentro de una cámara fría (0ºC a -60ºC). Tiene un sistema de avance mecánico del bloque, regulado por un cuentamicrones, acoplado a una rueda que sale al exterior y lo hace desplazarse sobre el filo del cuchillo.